细胞培养的基本步骤

细胞培养的基本步骤

‌细胞培养的基本步骤包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存。‌

‌细胞复苏‌：从液氮中取出冻存的细胞，迅速放入37℃水浴锅中融化。将融化的细胞移入离心管中，加入预热至37℃的DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)，轻轻吹匀后离心，500g离心2分钟，弃去上清液。再次加入DMEM完全培养基清洗后，制成细胞悬液，接种于培养皿或培养瓶中，放入含5% CO2的细胞培养箱中培养。‌

‌细胞传代‌：当细胞密度达到80%至90%时，需要进行传代。去除旧的培养基，用PBS缓冲液清洗两次。加入胰蛋白酶进行消化，显微镜下观察细胞状态，当胞质回缩且细胞不再连接成片时，加入DMEM完全培养基终止消化。离心后弃去上清液，加入新鲜的培养基重悬细胞，计算浓度后按适当比例接种到新的培养容器中。

‌细胞冻存‌：当细胞密度达到80%至90%时，进行冻存。去除旧的培养基，用PBS清洗两次。加入胰蛋白酶消化后，加入DMEM完全培养基终止消化并离心。弃去上清液后，加入冻存液(90%胎牛血清和10% DMSO)，轻轻吹打混匀后转移到冻存管中。将冻存管放入4℃冰箱中冻存30分钟，再放入-20℃冰箱中冻存30分钟，最后置于-80℃冰箱过夜，次日放入液氮中长期保存。

‌注意事项‌：

预热培养用液：将培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅中预热。

无菌操作：使用75%酒精擦拭超净工作台和双手，点燃酒精灯进行操作。

贴壁细胞消化适度：显微镜下观察细胞状态，适时终止消化。

传代操作：每次操作尽量靠近酒精灯火焰，避免交叉感染。