细胞培养的三大步骤

细胞培养的三大步骤

1.细胞复苏

准备工作：从液氮罐中取出冻存的细胞前，需要先准备好预热至 37°C 的水浴锅、合适的培养基和培养容器。例如，对于贴壁细胞，要准备好预先铺有细胞培养底物(如胶原蛋白)的培养瓶;对于悬浮细胞，准备好无菌的离心管和培养瓶。

复苏操作：迅速将冻存管从液氮中取出，放入 37°C 水浴锅中，快速摇晃使细胞悬液尽快解冻。解冻后，将细胞悬液转移到离心管中，加入适量的培养基，轻轻混匀后离心(一般 1000rpm，5 分钟)，去除上清液，再用新鲜培养基重悬细胞，然后接种到培养容器中，放入培养箱中培养。

2.细胞传代

判断传代时机：对于贴壁细胞，当细胞生长至汇合度达到 80% - 90% 左右时，就需要进行传代。汇合度是指细胞在培养容器底部生长覆盖的面积比例。可以通过显微镜观察来判断汇合度。对于悬浮细胞，当细胞密度达到一定程度(如每毫升 1×10⁶ - 1×10⁷个细胞)时，进行传代。

传代操作：以贴壁细胞为例，首先吸去旧的培养基，用 PBS(磷酸盐缓冲液)轻轻冲洗细胞表面，去除残留的培养基和血清。然后加入适量的胰蛋白酶溶液，在 37°C 孵育几分钟，使细胞从培养瓶底部脱离。加入含有血清的培养基终止胰蛋白酶的消化作用，轻轻吹打细胞，使细胞分散成单个细胞悬液。将细胞悬液按照一定比例(如 1:3 或 1:4)分装到新的培养瓶中，加入新鲜培养基，放入培养箱中继续培养。

3.细胞冻存

冻存液配制：常用的冻存液是由培养基、血清和冷冻保护剂(如二甲基亚砜，DMSO)组成。一般是含 10% - 20% 血清、10% DMSO 的培养基。DMSO 能够降低细胞在冷冻过程中的冰晶形成，减少对细胞的损伤。

冻存操作：先将细胞按照传代的方式制备成单细胞悬液，计数后，将细胞悬液与冻存液按照一定比例混合(如 1:1)，分装到冻存管中。将冻存管先放入 4°C 冰箱 30 分钟，然后转移到 - 20°C 冰箱 1 - 2 小时，再放入 - 80°C 冰箱过夜，最后转移到液氮罐中长期保存。液氮的温度极低(约 - 196°C)，可以使细胞处于休眠状态，长期保存细胞的活性。