细胞培养液支原体污染检测的方法有几种?

细胞培养液支原体污染检测的方法有几种?

细胞培养液支原体污染的检测方法主要有以下几种：

观察细胞形态和生长特征：支原体污染严重时，细胞可能出现生长减慢、形态改变(如肿胀、萎缩、变形等)、细胞质颗粒增多，培养基 pH 也可能明显变酸。但此方法不能准确诊断，因支原体污染引起的病变特征可能与病毒感染相似。

微生物培养法：将细胞培养物置于支原体肉汤液体培养基中，37℃培养 3 天后离心，将沉淀物转移至支原体固体琼脂培养基中继续培养。若培养基中出现类似煎鸡蛋样菌落，则细胞被支原体污染。该方法准确、可靠，但支原体生长缓慢，一般需培养 28 天左右，且敏感性不够高。

DNA 荧光染色法：利用荧光染料如 Hoechst 33258 标记细胞和支原体 DNA，荧光染料会结合到 DNA 的 A-T 富集区域，在紫外光激发下产生黄绿色荧光，通过荧光显微镜观察，若细胞核外有蓝色荧光颗粒，提示存在支原体污染。此方法操作简便，但灵敏度较低，细胞轻度污染时不易检出。

PCR 检测法：提取待测细胞上清或细胞 DNA，以支原体的 16S rRNA 核酸序列中高度保守序列设计引物，进行 PCR 扩增。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现目的片段，则表明存在支原体污染。该方法快速、灵敏，特异性较强。

荧光定量 PCR 法：在常规 PCR 基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量。通过 Ct 值及扩增曲线判断是否存在支原体污染，还可实现定量分析。其操作简便，敏感性高，能实时监控，适合样品模板含量较低时使用。

酶联免疫吸附测定(ELISA)法：利用 ELISA 试剂盒检测细胞培养上清液中的支原体抗原。此方法操作相对简单，不需要特殊设备，但可能存在一定的假阳性和假阴性结果。

电子显微镜观察法：通过电子显微镜或免疫电镜对样本进行观察，可直观看到支原体的形态和分布。该方法准确性较高，但受设备条件限制，检测时间长，敏感性不高。

间接免疫荧光法和免疫印迹法：这两种方法简便、快速且特异性强，若应用单克隆抗体试剂，效果会更好。

ATP 酶法：能够检测的支原体种类比较全，检测结果能够量化，容易判断，耗时短，整个实验过程通常需要 20 分钟左右。

一步法恒温支原体检测试剂盒法：该试剂盒采用恒温基因扩增技术和显色技术，对样品的支原体基因组 DNA 进行恒温扩增，通过反应管的颜色即可对结果进行判断。此方法方便、省时、灵敏度高，无需特殊设备。