细胞培养液中支原体污染的常用检测方法有哪些?

细胞培养液中支原体污染的常用检测方法有哪些?

细胞培养液中支原体污染的常用检测方法有培养法、DNA 染色法、PCR 检测法等，以下是具体介绍：

微生物培养法：这是检测支原体的经典方法，也是最可靠的方法。将细胞培养液接种到专用的支原体肉汤或琼脂培养基上，如 SP4 培养基，在 37℃条件下培养 2-4 周，观察培养基浑浊度或 pH 变化，也可通过 PCR 或染色进一步确认。该方法灵敏度高，但耗时长，部分支原体如 M. hyorhinis 难以培养。

DNA 荧光染色法：常用荧光染料为 Hoechst 33258.其可与支原体 DNA 特异性结合。将细胞接种于盖玻片上培养 24-48 小时，固定后进行 Hoechst 染色，避光孵育 30 分钟，在荧光显微镜下观察，若细胞核外有蓝色荧光颗粒，即为支原体 DNA，可证明存在支原体污染。此方法灵敏度高，可检测≤10 CFU/mL 的支原体，但需荧光显微镜，且可能出现假阳性，需结合其他方法验证。

PCR 检测法：以支原体 16S rRNA 或特异性基因为靶基因，取细胞上清或裂解细胞提取 DNA，使用商业试剂盒进行 PCR 扩增，然后通过电泳或 qPCR 分析结果。若出现支原体 DNA 特定条带，则表明存在污染。该方法快速灵敏，3-4 小时可出结果，灵敏度达 1-10 copies/μL，但需防止气溶胶污染导致假阳性。

酶联免疫吸附测定(ELISA)法：如 MycoAlert 检测方法，利用支原体细胞膜含有的高活性甘油磷酸酯磷酸二脂酶，将底物 ADHP 转化为荧光物质，在荧光检测仪上进行检测，从而判断样本是否含有支原体。该方法操作简单、快速，适合高通量的样本检测，但其灵敏度相对较低，对于低浓度的支原体感染可能无法准确检测。

直接观察法：使用相差显微镜或电子显微镜直接观察细胞培养物中是否存在支原体。相差显微镜下可观察到支原体呈小点状或丝状结构，在细胞周围或细胞质中移动。电子显微镜能提供更高分辨率的图像，清晰显示支原体的形态和结构。但此方法需要专业的设备和技术人员，且检测灵敏度相对较低。