轻度 / 中度污染的具体挽救步骤

轻度 / 中度污染的具体挽救步骤(分 3 代处理，逐步清除细菌)

细胞培养液被细菌污染后，挽救的核心目标是快速清除细菌、减少对细胞的损伤，但需明确：仅建议对珍贵细胞（如原代细胞、基因编辑细胞） 尝试挽救，常规细胞系(如 HeLa、HEK293)污染后建议直接丢弃(挽救成本高于重新复苏，且易导致污染扩散)。以下是分场景的具体挽救方法，需严格遵循无菌操作，避免污染扩散：

第一步：紧急处理(第 1 代：初步清除细菌，减少损伤)

无菌收集存活细胞

在超净台内，将污染的细胞培养瓶打开，用无菌移液器轻轻吸出上层浑浊培养液(尽量避免吸入漂浮的死细胞和大量细菌)，保留贴壁细胞(若为悬浮细胞，需先 1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，用无菌 PBS 重悬沉淀)。

用无菌 PBS（含 2× 双抗：200 U/mL 青霉素 + 200 μg/mL 链霉素） 冲洗细胞 2~3 次(每次冲洗后静置 1 分钟，轻轻晃动培养瓶，再吸出 PBS)，目的是冲洗掉附着在细胞表面的部分细菌和毒素。

更换含高浓度抗生素的完全培养基

配制 “抗生素强化培养基”：在无菌完全培养基中加入针对性抗生素(优先选择细菌敏感、细胞毒性低的种类)，推荐组合：

通用方案(未知细菌种类)：双抗(青霉素 + 链霉素)终浓度 200 U/mL + 庆大霉素终浓度 50 μg/mL(庆大霉素对革兰阴性菌效果更强，且不易被细菌耐药基因分解);

已知革兰阳性菌污染：可加万古霉素(终浓度 20 μg/mL);已知革兰阴性菌污染：可加多粘菌素 B(终浓度 10 μg/mL)。

注意：使用前需用未污染的同类型细胞做 “抗生素毒性预实验”(测试 2~3 个浓度，观察 24 小时，选择细胞形态正常的最高浓度)，避免抗生素对目标细胞造成不可逆损伤。

低浓度 CO₂培养

将处理后的细胞放入 37℃培养箱，暂时调低 CO₂浓度至 3%(细菌代谢易产酸，低 CO₂可减缓 pH 下降速度，避免细胞因酸性环境进一步受损)，培养 24 小时后观察。

第二步：巩固清除(第 2 代：降低抗生素浓度，监测细胞状态)

24 小时后显微镜检查：若培养液浑浊度明显降低，细菌数量减少(<5 个 / 视野)，细胞大部分贴壁、形态好转，可进行传代。

传代操作：

用胰酶消化贴壁细胞(或离心收集悬浮细胞)，1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清(去除残留的细菌和毒素)，用无菌 PBS 重悬细胞 1 次，再次离心。

更换 “低浓度抗生素培养基”：抗生素浓度减半(如双抗 100 U/mL + 庆大霉素 25 μg/mL)，避免长期高浓度抗生素对细胞代谢的抑制。

恢复正常 CO₂浓度(5%)，继续培养 24~48 小时，每天观察细菌数量和细胞状态。

第三步：停药观察(第 3 代：确认细菌清除，恢复正常培养)

若第 2 代培养后，培养液完全澄清，显微镜下未观察到细菌(连续观察 2 天)，细胞形态、生长速度恢复正常，可进行第 3 代传代。

传代时用无抗生素的完全培养基重悬细胞，正常培养(5% CO₂，37℃)，连续监测 3~5 天：

若期间无细菌复发(培养液澄清、细胞状态稳定)，说明挽救成功，后续可正常传代;

若再次出现细菌(即使少量)，说明细菌未彻底清除，需终止挽救，丢弃细胞(避免耐药菌产生或污染扩散)。