细胞培养液被细菌污染后，处理方式？

细胞培养液被细菌污染后，处理方式？

一、紧急处理：第一步先 “隔离 + 消毒”，防止污染扩散

无论是否挽救细胞，发现污染后需立即执行以下操作，阻断污染传播：

隔离污染样本

用 75% 酒精擦拭污染培养瓶外壁，快速转移至生物安全柜(或单独的无菌操作区)，远离未污染细胞、试剂(尤其是培养液、血清等易被污染的耗材)，瓶身标注 “细菌污染待处理”，避免他人误操作。

消毒操作环境

若在超净台内发现污染，立即关闭风机，用 75% 酒精擦拭台面、移液器、侧壁(重点清理可能溅出的污染液体)，静置 30 分钟后开启紫外灯照射 30 分钟(人员需撤离，避免紫外线伤害);

若污染液体不慎洒出，先用一次性纸巾吸干，再用含有效氯 1000mg/L 的消毒液(如 84 消毒液)擦拭污染区域，10 分钟后用 75% 酒精二次消毒。

个人防护

处理污染时戴双层一次性手套、口罩，必要时穿防护服;操作后脱卸防护用品时按 “先手套→再口罩→最后防护服” 的顺序，脱卸后用肥皂 + 流动水洗手，再用 75% 酒精消毒手部。

二、分场景处理：根据 “细胞价值 + 污染程度” 选择方案

场景 1：常规细胞系(无特殊价值)→ 直接丢弃，彻底灭菌

常规细胞系易获取(可通过冻存样本复苏)，挽救意义不大，且污染后易扩散，建议直接处理：

处理污染培养物

将污染的培养液(含细胞)直接倒入专用生物危害废物桶(桶内提前加入含有效氯 2000mg/L 的消毒液，确保污染液体被完全覆盖，杀灭细菌);

培养瓶 / 皿等耗材：若为一次性，放入医疗废物袋，经高压灭菌(121℃，30 分钟)后按医疗垃圾处理;若为可重复使用的玻璃耗材，需先在消毒液中浸泡 2 小时，再彻底清洗后高压灭菌，确认无菌后方可复用。

环境二次消毒

污染操作涉及的超净台、培养箱，需额外用支原体 / 细菌专用消毒剂(如含季铵盐的消毒液)擦拭，培养箱内可放置消毒包熏蒸 12 小时，避免残留细菌孢子。

场景 2：珍贵细胞(需挽救)→ 分 “轻度 / 中度污染” 分步清除细菌

仅当细菌污染为轻度（培养液轻微浑浊，400× 镜下细菌 < 10 个 / 视野，细胞仍大部分贴壁） 或中度（培养液明显浑浊，细菌 10~50 个 / 视野，部分细胞漂浮但仍有存活） 时，尝试挽救，重度污染(细菌满视野、细胞大量死亡)不建议挽救。具体步骤分 3 代进行，逐步清除细菌：

第一步：第 1 代 —— 紧急清除细菌，减少毒素损伤

无菌收集存活细胞

贴壁细胞：在生物安全柜内打开培养瓶，轻轻吸出上层浑浊培养液(尽量不扰动贴壁细胞)，用含 2× 双抗（200 U/mL 青霉素 + 200 μg/mL 链霉素）的无菌 PBS 冲洗细胞 2~3 次(每次冲洗后静置 1 分钟，轻轻晃动，去除附着在细胞表面的细菌和毒素)，最后一次冲洗后弃去 PBS。

悬浮细胞：将细胞悬液转移至无菌离心管，1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清(含大量细菌)，用上述含 2× 双抗的 PBS 重悬细胞，再次离心，重复 2 次，最后弃去 PBS。

更换 “抗生素强化培养基”

配制针对性抗生素培养基：根据细菌类型选择抗生素(若未知菌型，用 “广谱组合”)，推荐方案：

通用方案(覆盖革兰阳 / 阴性菌)：双抗(200 U/mL)+ 庆大霉素(50 μg/mL，针对革兰阴性菌)+ 万古霉素(20 μg/mL，针对革兰阳性菌);

已知革兰阴性菌(如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌)：双抗(200 U/mL)+ 多粘菌素 B(10 μg/mL，对阴性菌细胞壁破坏强);

已知革兰阳性菌(如葡萄球菌)：双抗(200 U/mL)+ 万古霉素(20 μg/mL)。

关键提醒：使用前需用未污染的同类型细胞做 “抗生素毒性预实验”—— 测试 2~3 个浓度(如 1×、2×、3×)，培养 24 小时观察细胞形态，选择 “细胞无明显损伤的最高浓度”，避免抗生素对目标细胞有毒性。

低 CO₂培养减少酸损伤

将处理后的细胞放入 37℃培养箱，暂时调低 CO₂浓度至 3%(细菌代谢易产酸，低 CO₂可减缓 pH 下降，避免细胞因酸性环境进一步受损)，培养 24 小时后观察。

第二步：第 2 代 —— 降低抗生素浓度，巩固清除效果

评估清除效果：24 小时后用 400× 镜观察，若培养液浑浊度明显降低、细菌数量减少(<5 个 / 视野)、细胞贴壁率回升(贴壁细胞)或漂浮减少(悬浮细胞)，则进行传代;若细菌无减少或细胞状态恶化，终止挽救，丢弃细胞。

传代与调整抗生素：

贴壁细胞用胰酶消化(消化时间略短于常规，避免细胞过度损伤)，悬浮细胞直接离心，1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，用无抗生素的无菌 PBS 重悬 1 次，再次离心，去除残留抗生素和细菌。

更换 “低浓度抗生素培养基”：抗生素浓度减半(如双抗 100 U/mL + 庆大霉素 25 μg/mL)，避免长期高浓度抗生素抑制细胞代谢，恢复 CO₂浓度至 5%，培养 24~48 小时。

第三步：第 3 代 —— 停药观察，确认细菌彻底清除

评估细胞与细菌状态：第 2 代培养后，若培养液完全澄清、镜下无细菌(连续观察 2 天)、细胞形态和生长速度恢复正常，进行第 3 代传代。

无抗生素培养与监测：

用不含任何抗生素的完全培养基重悬细胞，正常培养(37℃，5% CO₂)，连续监测 3~5 天：

若期间无细菌复发(培养液澄清、细胞状态稳定)，说明挽救成功，后续按常规方法培养，无需再加抗生素;

若再次出现细菌(即使少量)，说明细菌未彻底清除(可能存在耐药菌或细菌隐藏于细胞内)，需立即丢弃细胞，避免耐药菌扩散。

留存备份（可选）：挽救成功后，立即冻存 1~2 支细胞(用含 10% DMSO 的冻存液，按常规流程保存于 - 80℃或液氮)，作为后续实验的备用样本，避免后续培养中再次出现问题。