细胞培养液的无菌检测过程中需要注意哪些事项?

细胞培养液的无菌检测过程中需要注意哪些事项?

细胞培养液无菌检测的核心是避免 “外源性污染” 和 “假阴性 / 假阳性”，需从环境、操作、耗材、对照、培养观察等全流程把控，关键注意事项如下：

一、检测环境与人员：杜绝外源污染

必须在百级生物安全柜（或无菌操作台） 内操作，提前 30 分钟开启紫外消毒(≥30 分钟)，消毒后通风 10 分钟再开始工作，避免紫外残留损伤人员和影响检测。

人员需穿无菌服、戴无菌手套、口罩和帽子，手套需经 75% 酒精擦拭消毒，操作中避免手部直接接触耗材内壁(如试管口、滤膜)。

检测区域需定期清洁(用 0.5% 次氯酸钠或 75% 酒精擦拭台面)，定期做沉降菌检测(百级环境沉降菌≤1 CFU/4 小时)。

二、耗材与试剂：提前验证无菌性

所有耗材(滤膜、培养瓶、移液管、注射器等)需经正规灭菌(高压蒸汽 121℃/15 分钟或辐照灭菌)，使用前检查包装是否完好，避免使用破损、过期耗材。

培养基(TSA/TSB、SDA)需提前灭菌，灭菌后观察外观(澄清无浑浊、无沉淀)，并做空白培养验证(同检测条件培养 14 天，无菌生长)，避免培养基本身污染。

冲洗用无菌注射用水、缓冲液需现配现用，或选用商业化无菌产品，使用前核对无菌合格报告。

三、样品处理：避免操作误差

样品取样需无菌操作：开启培养液包装时，瓶口用 75% 酒精擦拭 2 次，待酒精挥发后再取样，避免瓶口残留酒精污染样品或抑制微生物生长。

采用薄膜过滤法时，控制过滤压力(0.1~0.3 MPa)，避免压力过高导致滤膜破损;过滤后确保滤膜完全贴合培养基表面，无气泡(气泡会影响微生物附着生长)。

若培养液含抗生素(如青霉素 - 链霉素)，需增加冲洗次数(3~5 次，每次 10~20 mL)，或延长冲洗时间，去除抑菌成分，避免假阴性。

四、对照设置：必做且规范

阳性对照、阴性对照必须与样品同批次、同条件同步检测，缺一不可 —— 阳性对照确保培养体系能检出微生物，阴性对照排除环境、耗材、试剂的污染。

阳性对照菌液浓度需控制在 10~100 CFU / 份(浓度过高易污染环境，过低可能检测不到)，接种后避免交叉污染到样品或阴性对照。

若阴性对照出现菌生长，需排查污染来源(环境、耗材、操作)，本次检测结果无效，需重新检测。

五、培养与观察：细节不遗漏

培养温度需精准控制：细菌培养(TSA/TSB)30~35℃，真菌培养(SDA)20~25℃，避免温度偏差导致微生物生长缓慢或不生长。

培养期间定期观察(第 3、7、14 天)，记录培养基是否浑浊、有无菌落 / 菌丝生长，避免因观察不及时错过微生物早期生长迹象。

培养结束后，若样品组无明显菌生长，需仔细观察培养基边缘、底部等死角，确认无微小菌落或浑浊后，再判定为合格。

六、异常处理：科学判定

若样品组出现菌生长，先排除交叉污染(对比阳性 / 阴性对照结果)，若确认是样品本身污染，直接判定无菌不合格，无需重复检测。

若检测结果异常(如阴性对照污染、阳性对照无菌生长)，需分析原因(操作失误、耗材污染、培养基失效等)，整改后重新取样检测，不可随意更改结果。

所有检测过程需详细记录(样品批号、耗材信息、操作时间、培养条件、观察结果等)，确保可追溯。