细胞培养液的无菌检测有哪些常见的方法?

细胞培养液的无菌检测有哪些常见的方法?

细胞培养液的无菌检测核心是 “检出细菌、真菌等活菌”，常见方法可分为传统培养法（金标准）、快速检测法、专项检测法三类，不同方法的灵敏度、耗时、适用场景差异显著，具体如下：

一、传统培养法(药典标准方法，优先选用)

核心原理：将样品接种至培养基，通过培养观察微生物生长，是无菌检测的 “金标准”，符合 ChP、USP、EP 等权威标准。

1. 薄膜过滤法(最常用，灵敏度高)

适用场景：绝大多数细胞培养液(澄清、低黏度)，尤其含抗生素的培养液(可通过冲洗去除抑菌成分)。

核心步骤：

取 10~20 mL 培养液，通过 0.45 μm 无菌滤膜(聚醚砜 / PES 材质)负压过滤，截留微生物;

用无菌缓冲液(pH 7.0 氯化钠 - 蛋白胨缓冲液)冲洗滤膜 3~5 次(每次 10~20 mL)，去除培养液中的抑菌物质;

将滤膜正面朝上，分别接种至两种培养基：

胰酪大豆胨培养基(TSA/TSB)：30~35℃培养 14 天(检测细菌);

沙氏葡萄糖培养基(SDA)：20~25℃培养 14 天(检测真菌);

观察培养基是否出现浑浊、菌落、菌丝。

优点：取样量大、截留微生物效率高，能避免抑菌成分干扰，假阴性率低;

缺点：耗时久(14 天)，操作相对繁琐。

2. 直接接种法(适用于黏稠 / 难过滤培养液)

适用场景：含血清量大、黏稠或含颗粒的培养液(如原代细胞专用培养基)，无法通过滤膜过滤的样品。

核心步骤：

取 2~5 mL 培养液，直接接种至 10~20 mL 胰酪大豆胨培养基(细菌检测)和沙氏葡萄糖培养基(真菌检测);

分别在 30~35℃(细菌)、20~25℃(真菌)培养 14 天;

观察培养基是否浑浊、有无微生物生长。

优点：操作简单，无需过滤设备;

缺点：取样量少，若微生物浓度低易漏检;含抑菌成分时无法去除，假阴性风险高于过滤法。

二、快速检测法(缩短检测周期，适用于应急需求)

核心原理：通过检测微生物代谢产物、核酸或酶活性，快速判断是否污染，无需等待 14 天培养。

1. 微生物代谢检测法

代表技术：ATP 生物发光法、CO₂释放法。

核心逻辑：微生物代谢会产生 ATP(能量物质)或 CO₂，通过试剂盒检测信号强度，判断是否存在活菌。

操作：取少量培养液，加入检测试剂，若存在微生物，ATP 与荧光素酶反应产生荧光(ATP 法)，或 CO₂与指示剂反应变色(CO₂法)，通过仪器读取信号。

优点：快速(1~4 小时出结果)，可批量检测;

缺点：无法区分细菌 / 真菌，易受培养液中杂质(如血清蛋白)干扰，仅能作为 “筛查工具”，不能替代传统培养法作为放行依据。

2. 核酸扩增检测法(PCR / 实时荧光 PCR)

代表技术：通用细菌 16S rRNA 基因 PCR、真菌 18S rRNA 基因 PCR。

核心逻辑：提取样品中微生物的核酸，通过 PCR 扩增特异性基因片段，若检测到目标条带，说明存在污染。

优点：快速(4~8 小时)，灵敏度极高(可检出 1~10 CFU/mL)，能区分微生物类型;

缺点：只能检测 “是否有核酸”，无法判断微生物是否存活(死菌也会检出)，易出现假阳性;需专业设备和技术人员，成本较高。

3. 微生物计数法(平板计数法)

适用场景：需快速估算污染菌数量的场景(如排查污染源头)。

核心步骤：将培养液梯度稀释(10⁻¹~10⁻⁶)，取稀释液涂布至 TSA/SDA 平板，培养 24~48 小时(细菌)或 48~72 小时(真菌)，计数菌落数(CFU/mL)。

优点：快速获得污染菌数量，直观反映污染程度;

缺点：仅适用于高浓度污染，低浓度污染易漏检;无法检测休眠态微生物。

三、专项检测法(针对传统方法无法检出的特殊微生物)

传统培养法无法检测支原体、病毒等特殊微生物，需针对性检测：

1. 支原体检测法

常用方法：PCR 法(首选)、培养法、Hoechst 染色法。

适用场景：支原体无细胞壁，常规培养基无法生长，是细胞培养的 “隐形污染”，必须专项检测。

核心逻辑：PCR 法检测支原体保守基因(如 16S rRNA)，培养法用专用支原体培养基(如 Hayflick 培养基)培养 21 天，染色法观察细胞染色体周围是否有支原体荧光。

2. 病毒检测法

常用方法：细胞病变法(CPE)、ELISA 法、PCR 法。

适用场景：含血清培养液(如胎牛血清可能携带牛病毒)、临床 / 制药用培养液，需排除病毒污染。

核心逻辑：将培养液接种至敏感细胞(如 Vero 细胞)，观察是否出现细胞病变(CPE 法);或检测病毒抗原(ELISA)、核酸(PCR)。