细胞培养液无菌检测的操作流程是怎样的?

细胞培养液无菌检测的操作流程是怎样的?

细胞培养液无菌检测的核心操作流程遵循 “准备 - 取样 - 处理 - 培养 - 观察 - 判定” 六步闭环，需严格遵循无菌操作规范和药典标准(ChP/USP/EP)，以下是两种最常用方法(薄膜过滤法、直接接种法)的详细操作流程，兼顾规范性与可落地性：

一、通用前期准备(两种方法均需执行)

1. 环境与人员准备

提前 30 分钟开启百级生物安全柜(紫外消毒 30 分钟→通风 10 分钟)，台面用 75% 酒精或 0.5% 次氯酸钠擦拭消毒。

人员穿戴无菌服、手套、口罩、帽子，手套用 75% 酒精擦拭消毒，避免接触非无菌物品。

2. 耗材与试剂准备

耗材：无菌滤膜(0.45 μm PES 材质)、滤杯、培养瓶(TSA/TSB、SDA)、移液管、注射器、无菌缓冲液(pH 7.0 氯化钠 - 蛋白胨缓冲液)。

试剂：胰酪大豆胨培养基(TSA/TSB，检测细菌)、沙氏葡萄糖培养基(SDA，检测真菌)、阳性对照菌液(金黄色葡萄球菌、白色念珠菌，10~100 CFU / 份)。

验证：培养基灭菌后做空白培养验证(同条件培养 14 天无菌)，滤膜检查完整性(无破损)。

3. 对照设置(必做，避免假阴 / 假阳)

阳性对照：2 份(细菌 + 真菌)，分别接种对应标准菌液。

阴性对照：1 份，用等量无菌缓冲液替代样品，按同流程操作。

空白对照：1 份，未接种任何样品的培养基，同条件培养。

二、方法一：薄膜过滤法(首选，适用于澄清 / 含抗生素培养液)

步骤 1：取样(无菌操作)

开启细胞培养液包装，瓶口用 75% 酒精擦拭 2 次(待酒精挥发)，用无菌移液管取 10~20 mL 样品(确保取样代表性，避免仅取上层清液)。

步骤 2：过滤除菌与微生物截留

将滤膜安装至滤杯，固定在负压过滤装置上，开启负压(压力控制在 0.1~0.3 MPa)。

缓慢注入样品，匀速过滤(避免产生气泡)，确保样品完全通过滤膜。

冲洗滤膜：用无菌缓冲液冲洗 3~5 次，每次 10~20 mL，冲洗时缓冲液缓慢流过滤膜表面(去除培养液中抑菌成分)。

步骤 3：滤膜转移与接种

关闭负压，无菌操作取出滤膜，正面朝上(截留微生物的一面)贴附在 TSA 培养基表面(细菌检测)，另取 1 张滤膜(同一样品)贴附在 SDA 培养基表面(真菌检测)。

转移时避免滤膜折叠、破损，确保滤膜与培养基完全贴合(无气泡)。

步骤 4：培养(精准控温)

细菌培养：TSA 培养基置于 30~35℃培养箱，培养 14 天。

真菌培养：SDA 培养基置于 20~25℃培养箱，培养 14 天。

阳性对照、阴性对照、空白对照同步培养。

步骤 5：观察与记录

分别在培养第 3、7、14 天观察，记录培养基是否浑浊、有无菌落 / 菌丝生长。

重点观察滤膜边缘、培养基角落等死角，避免遗漏微小菌落。

三、方法二：直接接种法(适用于黏稠 / 难过滤培养液)

步骤 1：取样(无菌操作)

同薄膜过滤法，取 2~5 mL 样品(取样量需满足检出阈值)。

步骤 2：直接接种培养基

取 2 个无菌培养瓶(TSA+SDA)，分别注入 10~20 mL 对应培养基(已灭菌)。

用无菌移液管将样品缓慢注入培养基，轻轻颠倒混匀(避免样品飞溅污染瓶口)。

步骤 3：培养(同薄膜过滤法)

TSA 培养基 30~35℃培养 14 天(细菌)，SDA 培养基 20~25℃培养 14 天(真菌)。

对照样品同步培养，液体培养基需静置或轻微振荡培养(确保微生物接触营养)。

步骤 4：观察与记录

培养第 3、7、14 天观察，液体培养基需轻轻摇晃后查看是否浑浊、有无沉淀 / 菌膜;固体培养基观察有无菌落生长。

若对照异常，本次检测结果无效，需排查原因后重新检测;

若样品组合格且对照有效，判定为无菌合格;反之则不合格。

四、关键操作要点

全程无菌操作，避免手部接触滤膜、培养基表面、瓶口等关键部位。

过滤压力不可过高，滤膜转移时确保正面朝上(否则微生物无法生长)。

含抗生素的培养液需增加冲洗次数(5 次)，避免抑菌成分导致假阴性。

培养时间不可缩短(常规 14 天)，缓慢生长的微生物需满周期观察。