细胞培养液无菌检测的准备阶段需要做哪些工作?

细胞培养液无菌检测的准备阶段需要做哪些工作?

细胞培养液无菌检测的准备阶段是避免外源性污染、确保检测结果准确的核心，需从环境、人员、耗材试剂、样品、对照设置五个维度全面落实，具体工作如下：

一、环境准备：打造无菌检测空间

核心环境搭建

必须在百级生物安全柜（或无菌操作台） 内进行操作，提前 30 分钟开启设备：先开紫外消毒 30 分钟(杀灭环境微生物)，消毒后关闭紫外，通风 10 分钟(避免紫外残留损伤人员和后续微生物生长)，同时开启风机净化空气。

检测区域台面用 0.5% 次氯酸钠溶液或 75% 酒精擦拭消毒(从内向外单向擦拭)，周边避免放置非无菌物品，确保操作空间整洁。

环境合规验证

定期(每月 1 次)做沉降菌检测：在生物安全柜内放置 TSA 培养基平板，开盖暴露 4 小时后培养，百级环境要求沉降菌≤1 CFU/4 小时，若超标需排查污染源(如过滤器失效、通风不良)并整改。

检查培养箱：提前校准温度(细菌培养 30~35℃、真菌 20~25℃)，确保温度波动≤±1℃;培养箱内用 75% 酒精擦拭消毒，避免残留微生物污染培养基。

二、人员准备：规范无菌操作行为

个人防护装备（PPE）穿戴

按顺序穿戴无菌服、无菌手套、口罩、帽子，确保头发、口鼻、手臂完全覆盖，避免皮肤接触样品或耗材。

手套需用 75% 酒精擦拭消毒，操作过程中若手套接触非无菌物品(如桌面、手机)，需重新更换手套。

操作前培训与规范

人员需熟悉检测流程(如薄膜过滤法、直接接种法)，明确关键步骤(如滤膜转移、冲洗操作)的注意事项，避免操作失误。

操作前避免接触化妆品、护手霜等可能含抑菌成分的物品，手部不可直接触碰滤膜、培养基表面、瓶口等关键部位。

三、耗材与试剂准备：验证无菌性与有效性

耗材选型与灭菌验证

核心耗材清单：0.45 μm 聚醚砜(PES)滤膜(截留微生物效率高)、滤杯、负压过滤装置、无菌培养瓶 / 平板(TSA、SDA 专用)、移液管、注射器、无菌离心管、取样瓶。

耗材要求：需经正规灭菌(高压蒸汽 121℃/15 分钟或辐照灭菌)，使用前检查包装是否完好、有无破损 / 过期;滤膜需单独检查完整性(无针孔、裂纹)，避免使用不合格耗材。

试剂准备与质量验证

培养基：胰酪大豆胨培养基(TSA/TSB，检测细菌)、沙氏葡萄糖培养基(SDA，检测真菌)，需提前灭菌(121℃/15 分钟高压蒸汽灭菌)，灭菌后观察外观(澄清无浑浊、无沉淀、颜色正常)，并做空白培养验证(同检测条件培养 14 天，无菌生长)，确保培养基无污染、营养成分未降解。

缓冲液与溶剂：pH 7.0 氯化钠 - 蛋白胨缓冲液(用于冲洗滤膜，去除抑菌成分)、无菌注射用水(用于稀释或冲洗)，需现配现用或选用商业化无菌产品，使用前核对 CoA 报告(无菌合格)。

辅助试剂：75% 酒精(消毒用)、0.5% 次氯酸钠(台面消毒用)，需在有效期内使用，避免浓度过高或过低影响消毒效果。

四、样品准备：确保取样代表性与无菌性

样品取样规范

取样前核对样品信息：确认培养液批号、名称、储存条件，检查包装是否完好、有无漏液、外观是否正常(若浑浊、有沉淀，需先记录，后续检测时重点关注)。

无菌取样操作：开启样品包装时，瓶口用 75% 酒精擦拭 2 次，待酒精完全挥发后再取样(避免酒精残留抑制微生物生长);用无菌移液管或注射器取样，取样量需符合检测要求(薄膜过滤法 10~20 mL，直接接种法 2~5 mL)，确保取样代表性(避免仅取上层清液，需摇匀后取样)。

样品预处理（按需进行）

含抗生素的培养液：需提前规划冲洗步骤(后续过滤时增加冲洗次数 / 冲洗量)，避免抑菌成分导致假阴性。

黏稠 / 含颗粒的培养液：若无法直接过滤，需选择直接接种法，或经 5.0 μm 预过滤去除颗粒后再用薄膜过滤法检测。

冷冻储存的培养液：需在 2~8℃缓慢解冻，避免反复冻融，解冻后摇匀再取样。

五、对照设置准备：避免假阴 / 假阳结果

对照样品制备

阳性对照：准备 2 份，分别接种 10~100 CFU 的标准菌株(细菌用金黄色葡萄球菌 ATCC 6538.真菌用白色念珠菌 ATCC 10231)，用于验证培养体系是否有效(能支持微生物生长)。

阴性对照：准备 1 份，用等量无菌缓冲液或注射用水替代样品，按后续检测流程操作，用于验证环境、耗材、试剂无外源性污染。

空白对照：准备 1 份，直接使用未接种任何样品的 TSA/SDA 培养基，同条件培养，用于验证培养基本身无菌。

对照标记与隔离

对所有对照样品进行清晰标记(如 “阳性对照 - 细菌”“阴性对照”)，避免与检测样品混淆。

接种对照样品时，需与检测样品分区操作(如生物安全柜左侧接种对照，右侧接种样品)，尤其避免阳性对照菌液污染检测样品或阴性对照。

核心准备要点总结

所有接触样品、培养基的耗材和试剂，必须确保无菌;

环境、人员的无菌控制是基础，任何一个环节失守都会导致结果失真;

对照设置是 “生命线”，必须提前准备到位，不可省略;

取样和样品预处理需贴合检测方法(薄膜过滤法 / 直接接种法)，避免影响后续操作。