细胞培养液无菌检测的准备阶段，如何设置对照?

细胞培养液无菌检测的准备阶段，如何设置对照?

细胞培养液无菌检测准备阶段的对照设置，核心是通过 “阳性对照 + 阴性对照 + 空白对照” 三重验证，排除假阴性 / 假阳性，确保检测结果可靠，具体设置方法、操作规范及核心目的如下：

一、对照类型与设置方法(按优先级排序，缺一不可)

1. 阳性对照：验证培养体系有效性(必设)

核心目的：确认检测用培养基、培养条件能支持微生物生长，避免因培养基失效、抑菌成分残留导致假阴性。

设置步骤：

选择标准菌株：细菌用金黄色葡萄球菌（ATCC 6538），真菌用白色念珠菌（ATCC 10231）(符合 ChP/USP 标准);

菌液制备：将标准菌株接种至 TSA/SDA 培养基活化，稀释至10~100 CFU / 份(浓度过高易污染环境，过低可能检测不到);

接种操作：准备 2 份对照样品(细菌 + 真菌各 1 份)，分别取 0.1~0.2 mL 菌液，按检测样品流程处理(如薄膜过滤法需与样品同步过滤、冲洗，直接接种法需接种至对应培养基);

标记与培养：清晰标注 “阳性对照 - 细菌”“阳性对照 - 真菌”，与样品同步培养(细菌 30~35℃、真菌 20~25℃，培养 14 天)。

2. 阴性对照：验证环境 / 耗材 / 试剂无菌性(必设)

核心目的：排除检测过程中环境、耗材、试剂(如缓冲液、酒精)带来的外源性污染，避免假阳性。

设置步骤：

替代样品：用等量无菌缓冲液（pH 7.0 氯化钠 - 蛋白胨缓冲液） 或无菌注射用水，替代细胞培养液;

同步操作：按检测样品的完整流程处理(取样、过滤 / 接种、培养)，确保所有操作步骤、耗材、培养条件与样品完全一致;

标记与培养：标注 “阴性对照”，与样品、阳性对照同步培养 14 天。

3. 空白对照：验证培养基本身无菌性(补充设置)

核心目的：单独验证检测用培养基(TSA/TSB、SDA)未被污染，避免因培养基本身带菌导致误判。

设置步骤：

直接取用未接种任何样品、菌液的空白培养基(与检测样品用同批次培养基);

标记与培养：标注 “空白对照 - 细菌”“空白对照 - 真菌”，与其他对照、样品同步培养 14 天。

二、对照设置关键规范(避免对照失效)

批次同步：所有对照(阳性、阴性、空白)必须与检测样品为同批次设置、同条件培养(同一培养箱、同一时间段)，不可单独设置或更改培养条件。

分区操作：在生物安全柜内划分专属操作区域 —— 先处理空白对照、阴性对照、检测样品，最后处理阳性对照，避免阳性菌液污染其他样品 / 对照。

耗材独立：对照设置需使用独立的无菌耗材(移液管、滤膜、培养瓶)，不可与检测样品共用，防止交叉污染。

浓度精准：阳性对照菌液浓度必须控制在 10~100 CFU / 份，可通过平板计数法提前校准，避免浓度过高导致环境污染，或浓度过低无法验证培养体系有效性。

标记清晰：每个对照样品需明确标注 “对照类型 + 检测对象 + 日期 + 操作者”，如 “阳性对照 - 真菌 - 20240520-XXX”，避免混淆。

三、特殊场景补充设置(按需调整)

含抗生素的培养液检测：需额外设置 “抗生素抑制验证对照”—— 在阳性对照菌液中加入与样品同等浓度的抗生素，若阳性对照仍能生长，说明抗生素未抑制微生物，检测流程有效;若无法生长，需增加冲洗次数后重新检测。

支原体专项检测：单独设置支原体阳性对照(如肺炎支原体标准株)和阴性对照(无菌缓冲液)，采用支原体 PCR 法或培养法同步检测，避免支原体 “隐形污染” 漏检。

临床 / 制药用培养液检测：需增加 “系统适用性对照”—— 将阳性对照菌液与样品混合后检测，验证样品中的成分不会抑制微生物生长，确保检测体系无干扰。

核心总结

对照设置的本质是 “自我验证检测体系的可靠性”：阳性对照确保 “能检出污染”，阴性对照确保 “不被外界污染”，空白对照确保 “培养基本身干净”。只有三重对照均合格，检测样品的结果才具备参考价值，否则需排查问题后重新检测。