细胞培养类试剂的无菌性检测方法有哪些?

细胞培养类试剂的无菌性检测方法有哪些?

细胞培养类试剂的无菌性检测核心是检出细菌、真菌等活菌，同时需兼顾支原体这类 “隐形污染” 微生物，检测方法分为传统培养法(药典金标准)、快速筛查法、专项检测法三大类，不同方法适用于不同试剂类型和检测需求，具体如下：

一、 传统培养法(适用于所有细胞培养类试剂，合规性首选)

该方法是《中国药典》《美国药典》推荐的无菌检测金标准，通过培养观察微生物生长，结果准确可靠，分为薄膜过滤法和直接接种法。

1. 薄膜过滤法(首选，适用于澄清试剂：培养基、PBS、添加剂溶液等)

核心原理：用 0.45 μm 聚醚砜(PES)滤膜截留试剂中的微生物，冲洗去除试剂中的抑菌成分(如抗生素)，再将滤膜转移至培养基培养，观察是否有菌落生长。

操作步骤：

取 10~20 mL 试剂，在百级生物安全柜内通过无菌滤膜负压过滤;

用 pH 7.0 氯化钠 - 蛋白胨缓冲液冲洗滤膜 3~5 次(每次 10~20 mL)，去除抑菌成分;

将滤膜正面朝上分别贴于胰酪大豆胨培养基(TSA/TSB，检测细菌)和沙氏葡萄糖培养基(SDA，检测真菌)表面;

细菌培养：30~35℃培养 14 天;真菌培养：20~25℃培养 14 天;

同步设置阳性对照(接种金黄色葡萄球菌、白色念珠菌)和阴性对照(无菌缓冲液替代试剂)。

判定标准：无浑浊、无菌落 / 菌丝生长为合格;阳性对照需生长，阴性对照需无菌，否则结果无效。

2. 直接接种法(适用于黏稠 / 难过滤试剂：血清、冻存液、胶原酶溶液等)

核心原理：将试剂直接接种至液体培养基，避免过滤对黏稠试剂的截留干扰，通过培养观察培养基是否浑浊。

操作步骤：

取 2~5 mL 试剂，无菌操作接种至 10~20 mL TSB(细菌)和 SDA(真菌)培养基中，轻轻混匀;

细菌 30~35℃培养 14 天，真菌 20~25℃培养 14 天，期间定期摇晃观察;

同样设置阳 / 阴性对照。

判定标准：培养基澄清无浑浊、无沉淀为合格;若浑浊，可取少量培养液涂布平板，确认是否为微生物生长。

二、 快速筛查法(适用于实验室日常快速验证，不能替代传统培养法)

这类方法检测周期短(1~8 小时)，适合试剂开封后快速筛查污染，常用作辅助手段。

1. ATP 生物发光法

核心原理：微生物代谢会产生 ATP(能量物质)，ATP 与荧光素酶反应产生荧光，荧光强度与微生物数量正相关。

适用场景：培养基、PBS 等澄清试剂的快速筛查，30 分钟～1 小时出结果。

优缺点：快速便捷，但易受试剂中血清蛋白、酶类等杂质干扰，无法区分细菌 / 真菌，仅能定性筛查。

2. 荧光 PCR 法

核心原理：扩增微生物保守基因(细菌 16S rRNA、真菌 18S rRNA)，通过荧光信号判断是否存在微生物核酸。

适用场景：应急排查污染(如细胞培养突然污染时，快速判断是否为试剂污染)，4~8 小时出结果。

优缺点：灵敏度极高(可检出 1 CFU/mL)，但无法区分活菌 / 死菌，易出现假阳性，不能作为合规放行依据。

3. 平板涂布计数法

核心原理：将试剂梯度稀释后涂布至 TSA/SDA 平板，培养后计数菌落数(CFU/mL)。

适用场景：估算试剂污染程度(如已发现浑浊时)，24~48 小时出结果。

优缺点：可定量，但低浓度污染易漏检，适合高污染样品的快速评估。

三、 专项检测法(针对传统培养法无法检出的特殊微生物)

细胞培养类试剂的 “隐形污染”(支原体、病毒)无法通过常规细菌 / 真菌培养检出，需针对性检测。

1. 支原体检测(所有细胞培养试剂必检)

支原体无细胞壁，在常规培养基中不生长，是细胞培养的高频污染源。

2. 病毒检测(临床 / 生产用试剂必检)

针对血清、动物源添加剂等可能携带的病毒，常用方法：

细胞病变法(CPE)：将试剂接种至敏感细胞(如 Vero 细胞)，培养观察是否出现细胞病变(如圆缩、脱落);

ELISA 法：检测病毒抗原(如血清中的牛病毒性腹泻病毒 BVDV);

荧光定量 PCR 法：检测病毒核酸，灵敏度高，适合批量筛查。

核心注意事项

所有检测需在百级生物安全柜内进行，避免环境污染导致假阳性;

阳 / 阴性对照必须同步设置，否则检测结果无效;

含抗生素的试剂需增加滤膜冲洗次数(5 次以上)，或稀释后检测，避免抑菌成分导致假阴性。